Молекулярная основа β

Nature Communications, том 14, номер статьи: 4268 (2023) Цитировать эту статью

860 Доступов

1 Альтметрика

Подробности о метриках

Пенициллин-связывающие белки (PBP) необходимы для формирования клеточной стенки бактерий. Они также являются мишенью β-лактамных антибиотиков. У Enterococcus faecium высокие уровни устойчивости к β-лактамам связаны с экспрессией PBP5, причем более высокие уровни устойчивости связаны с отдельными вариантами PBP5. Чтобы определить молекулярный механизм устойчивости, опосредованной PBP5, мы использовали биомолекулярную ЯМР-спектроскопию PBP5, которая из-за его размера (> 70 кДа) является сложной мишенью для ЯМР. Наши данные показывают, что устойчивые варианты PBP5 демонстрируют значительно повышенную динамику как отдельно, так и при образовании комплекса ацил-ингибитор фермента. Кроме того, эти варианты также демонстрируют повышенный гидролиз ацил-ферментов. Таким образом, уменьшение объема боковой цепи и расширение поверхностных петель приводит к усилению динамики, которая облегчает гидролиз ацил-ферментов и, за счет увеличения оборота β-лактамных антибиотиков, способствует устойчивости к β-лактамам. В совокупности эти данные обеспечивают молекулярную основу устойчивости клинических вариантов PBP5 E. faecium, результаты, которые, вероятно, применимы к семейству PBP.

Enterococci faecium, возбудитель ESKAPE, вызывает тяжелые и часто смертельные нозокомиальные и внебольничные инфекции1,2,3. Эффективному лечению препятствует повышенная устойчивость ко многим классам антибиотиков, особенно к β-лактамам4,5,6. Эти антибиотики нацелены на пенициллин-связывающие белки (PBP), которые являются частью группы ферментов, образующих слой пептидогликана, важнейшего компонента бактериальной клеточной стенки, который необходим для выживания клеток7,8. PBP обладают транспептидазной, карбоксипептидазной или эндопептидазной активностью, которая синтезирует новые и реконструирует существующие пептидогликаны9. PBP классифицируются по их ферментативной активности: (а) класс A, бифункциональные PBP, обладающие как гликозилтрансферазной, так и транспептидазной активностью; (б) класс В – транспептидазы; и (c) класс C, карбоксипептидазы и эндопептидазы9.

У энтерококков сниженная чувствительность к β-лактамным антибиотикам, включая пенициллин и анти-MRSA цефалоспорин (или цефтаролин), является результатом экспрессии одного, так называемого, низкого сродства PBP класса B, обозначенного PBP5, у E. faecium10,11. Родственные PBP придают устойчивость к β-лактамам у E. faecalis (PBP4) и Staphylococcus aureus (PBP2a)12. PBP класса B имеют четыре отдельных, сильно взаимосвязанных домена: (a) N1, который связывает встраивающуюся в мембрану спираль с доменом транспептидазы (TP); (б) N2, функция которого неизвестна; (c) nPB, который связывает N1 и N2 с доменом TP и (d) домен TP, который включает активный сайт (рис. 1A, B, дополнительные рис. 1A, B)13. Нуклеофильный серин (S422) расположен на N-конце спирали α2, тогда как оксианионная дырка определяется атомами азота основной цепи S422 и T620 (рис. 1B, справа). Борозда активного центра сверху окружена «крышкой» (а.к. 443–471), а снизу – С-концевой спиралью (а.к. 655–678), которые вместе определяют глубокую щель, связывающую β-лактам (рис. 1B, слева; Дополнительный рисунок 1C – E) 14.

Доменная структура PBP5, окрашенная в соответствии с четырьмя отдельными доменами: N-концевой домен 1 (N1), синий; N-концевой домен 2 (N2), темно-серый; непенициллинсвязывающий домен (nPB), светло-серый; транспептидазный домен (TP), зеленый. Показаны номера остатков при доменных переходах. B Кристаллическая структура PBP5 (PDBid 6MKA), окрашенная доменами, как описано в A. N- (остаток 37) и C-конец (остаток 678) помечены, а каталитический серин (S422) показан в виде красных палочек и помечен. . На вставке: поверхностное изображение домена TP в виде ацил-аддукта с penG (PDBid 6MKG). PenG показан в виде красных палочек. Остатки PBP5 в пределах 5 Å от penG окрашены в желтый цвет, подчеркивая бороздку для связывания β-лактама. Эта бороздка окружена «крышкой» PBP5 (443–471 а.к.) и С-концевой спиралью (655–671 а.к.), как указано на этикетке. C 2D [1H,15N] TROSY-спектр PBP5 (перевернутый). D График относительной интенсивности усиления парамагнитной релаксации PBP5 S231C-MTSL (PRE) в зависимости от количества остатков. Верхняя полоса окрашена доменом PBP5; остатки с пониженными значениями PRE окрашены в голубой цвет. Остатки E PBP5 S231C с восстановленными PRE нанесены на структуру PBP5 (PDBid: 6MKA) в виде голубых шариков. Указаны статические расстояния между доменами. F График относительной интенсивности PRE PBP5 S459C-MTSL в зависимости от количества остатков. Верхняя полоса окрашена доменом PBP5; остатки с пониженными значениями PRE окрашены в голубой цвет. G PBP5 S459C Остатки PRE с восстановленными PRE нанесены на структуру PBP5 (PDBid: 6MKA) в виде голубых шариков. Указаны статические расстояния между доменами. H Структуры открытого и закрытого состояний PBP5 (открытое состояние: N1, светло-голубой, N2, темно-серый, nPB, светло-серый и TP, светло-зеленый; закрытое состояние: N1, светло-голубой, N2, серый; nPB и TP). перекрываются идентично открытому состоянию). Динамика домена PBP5 наблюдалась (зеленые стрелки) и не наблюдалась (красные стрелки с буквой «X») в растворе с использованием экспериментов PRE. Исходные данные предоставляются в виде файла исходных данных.